Флуоресценция

Введение

Все вещества при сильном нагревании начинают излучать электромагнитную энергию. Излучение нагретых веществ называют тепловым равновесным излучением. Однако некоторые вещества излучают электромагнитную энергию без нагревания – при комнатной температуре. Такое излучение называют люминесценцией, а люминесцентные вещества – люминофорами. В отличие от теплового, люминесценция является неравновесным излучением.

По В. Л. Левшину, люминесценция – это свечение атомов, молекул, ионов и других более сложных комплексов, возникающее в результате электронного перехода в этих частицах при их возвращении из возбужденного состояния в нормальное.

Метод молекулярной люминесцентной спектроскопии характеризуется высокой чувствительностью (порядок обнаружения 10-3 мг/мл), так как относится к силовым – выходной сигнал увеличивается с увеличением интенсивности источника излучения. В идеальных условиях удается достичь пределов обнаружения на уровне пикограммов в миллилитре.

В реферате приведена классификация методов люминесценции по способу возбуждения, механизму и длительности, описаны схемы Яблонского.

История

• По словам монаха Сун Цан-Нина (919–1001), император Китая Чжао Куанъи (976–997) имел картину, изображающую при дневном свете буйвола, пасущего на траве перед своей конюшней. Ночью картина изменилась: буйвол был в своей конюшне. Он объясняет это явление использованием краски, смешанной со специальным веществом, сделанным из жемчужной раковины, для ночной сцены и краски, смешанной с пылью от определенной породы, выброшенной в море вулканом. Поэтому возможно, что китайцы открыли задолго до Кантона (1768 г.) фосфор, полученный из раковин устриц, но это совсем не обязательно, потому что в некоторых из его сочинений монах Сун Цан-Нин особенно сказочен. В любом случае, это самое старое из известных упоминаний о созданном человеком материале, способном сохранять дневной свет, а затем восстанавливать его.
• Этот процесс был случайно открыт болонским сапожником и алхимиком Винченцо Каскариоло (1571-1624) в 1603 году.

• Термин происходит от минерала флюорита, который очень часто проявляет флуоресценцию, а также триболюминесценцию или даже термолюминесценцию , но не фосфоресцирует.
• Именно Стокс изобрел слово «флуоресценция» в 1852 году. Он опубликовал в « Философских трудах» Королевского общества свои наблюдения над явлением, которое он предложил назвать флуоресценцией (вместо дисперсионного отражения ), в статье, озаглавленной « Об изменении преломляемости света» . Термин был введен в 1853 году.

Минералы, которые могут флюоресцировать

О других проектах Викимедиа:

Флуоресценция , на Викискладе?

Adamite , альбит , аллофан , алунит , амблигонит , анальцим , андалузит , англезит , ангидрит , анкерит , антофиллит , арагонит , урановые слюдки , бенитоит , берлинит , кальцит , целестин , cerusite , шамозит , charlesite , чароит , колеманит , корунд , кристобалит , криолит , данбурю , датолит , диаспоры , диопсид , кианит , доломит , эпидот , эритрит , флюорит , фторапатитовый , гипс , галит , гаюин , гемиморфит , гейландит , жадеит , ломонтит , lussatite , manganaxinite , magnesio-аксинит , магнезит , melanophlogite , диабет , микроклины натролит , окенит , олигоклаз , опал , пектолит , периклаз , флогопит , фосгенит , пренит , кварц , родонит , шеелитовые , сколецит , смитсонит , содалит , сфалерит , шпинели , сподумен , стронцианит , тенардит , топаз , торбернит , тремолит , тридимит , уваровито , Варисцит , волластонит , вульфенит , цоизит .

внешняя ссылка

• Введение в флуоресценцию .
• База данных флуоресцентных красителей .
• Основные принципы флуоресцентной спектроскопии.
• Применения флуоресценции . Архивировано 27 июля 2017 года в Wayback Machine .
• http://jobinyvon.com/SiteResources/Data/Templates/1divisional.asp?DocID=514&v1ID=&lang=
• Интерактивная база данных флуоресцентных красителей и фильтров .
• Таблицы нормативов срока службы флуоресценции ISS .
• Таблицы данных флуоресцентных датчиков ISS .
• Фонд флуоресценции .
• Fluorophores.org База данных флуоресцентных красителей .
• Диаграмма Яблонского .
• Флуоресценция в Scienceworld .
• Основные понятия флуоресценции .
• Обнаружение скорпиона с помощью УФ-светодиодов .
• Протокол иммунофлуоресценции .
• Пример использования флуоресценции при генерации клеточных изображений .
• Разница между флуоресценцией и свечением в темноте .
• Еще примеры использования флуоресценции .
• Флуоресценция в цифровой фотографии .
• Влияние флуоресценции в мире искусства .
• Контроль флуоресценции фотонными кристаллами — ICMM .
• Общество флуоресцентных минералов .
• Флуоресценция на практике .
• Лаборатория динамики флуоресценции .
• «Наноистория флуоресценции», лекция Дэвида Джеймсона .
• Спектры возбуждения и испускания различных флуоресцентных красителей .
• Микроскопия Манавату .
• Методика наблюдения за флуоресценцией морских организмов .
• История и научные исследования биологического значения морской биофлуоресценции (на английском и немецком языках) .

Контроль властей	Проекты Викимедиа Данные: Q191807 Мультимедиа: Идентификаторы BNF 119786466 (данные) GND 4154818-8 LCCN sh85049407 NDL 00565352 AAT 300056211 Словари и энциклопедии Британика url Медицинские идентификаторы MeSH D005453 Ontologías Номер IEV: 845-24-023

• Datos: Q191807
• Multimedia:

использованная литература

1. Принципы инструментального анализа Ф. Джеймс Холлер, Дуглас А. Скуг и Стэнли Р. Крауч 2006
2. ↑
3. Саффорд, Уильям Эдвин (1916). « Lignum nephriticum » . Годовой отчет Попечительского совета Смитсоновского института . Вашингтон: Государственная типография. С. 271-298.
4. Valeur, B .; Берберан-Сантос, MRN (2011). «Краткая история флуоресценции и фосфоресценции до появления квантовой теории». Журнал химического образования 88 (6): 731
5. «Флуоресценция Lignum nephriticum: возврат в прошлое и простая демонстрация флуоресценции природных веществ» .
6. Эдвард Дэниел Кларк (1819) «Отчет о вновь открытой разновидности зеленого флуоресцентного лонжерона очень необычной красоты, с замечательными свойствами цвета и фосфоресценции», « Анналы философии », 14  : 34 — 36; со страницы 35: «Более мелкие кристаллы совершенно прозрачны. Их цвет в проходящем свете — интенсивный изумрудно-зеленый ; но в отраженном свете — цвет глубокого сапфирово-синего цвета ;…».
7. Хауи просто повторяет наблюдение Кларка относительно цвета образца флюорита, который он (Кларк) исследовал: Haüy, Traité de Minéralogie , 2-е изд. (Париж, Франция: Башелье и Юзар, 1822 г.), т. 1, page 512. Хауи назвал флюорит «chaux fluatée». Со страницы 512 : «… фиолетовое отражение, и вердатр прозрачное в Дербишире». ( фиолетовый при отражении и зеленоватый при пропускании в Дербишира.)
8. Дэвид Брюстер (1834) «О цветах природных тел», Труды Эдинбургского королевского общества 12  : 538-545; на странице 542 Брюстер упоминает, что когда белый свет проходит через спиртовой раствор хлорофилла, от него отражается красный свет.
9. Véase: * Herschel, John (1845a) «О случае поверхностного цвета, представленного однородной жидкостью, внутренне бесцветной», Philosophical Transactions of the Royal Society of London , 135  : 143-145; см. стр. 145. * Гершель, Джон (1845b) «Об эпиплическом рассеянии света, будучи дополнением к статье под названием« О случае поверхностного цвета, представленного однородной жидкостью, внутренне бесцветной »,« Философские труды Королевского общества » of London , 135  : 147-153.
10. «Я почти склонен придумать слово и назвать внешний вид флуоресценцией от флюоритового шпата , поскольку аналогичный термин опалесценция происходит от названия минерала». Стокс, GG (1852). «Об изменении преломляемости света» . Философские труды Лондонского королевского общества 142 : 463-562. DOI 10.1098 / rstl.1852.0022 . Со страницы 479, сноска: «Я почти склонен придумать слово и назвать внешний вид флуоресценцией от флюорита-шпата, поскольку аналогичный термин опалесценция происходит от названия минерала».
11. Стокс (1852), страницы 472-473. В сноске на странице 473 Стокс признает, что в 1843 году Эдмон Беккерель заметил, что сульфат хининовой кислоты сильно поглощает ультрафиолетовое излучение (т. Е. Солнечное излучение за пределами H-диапазона Фраунгофера в солнечном спектре). См .: Эдмон Беккерель (1843) «Des effets produits sur les corps par les rayons solaires» (О влиянии солнечных лучей на вещества), Comptes rendus , 17  : 882-884; на странице 883 Беккерель цитирует сульфат хининовой кислоты («сульфат-ацид де хинина») как сильно поглощающий ультрафиолетовый свет.
12. Скуг, Дуглас А. (2001). «15». Принципы инструментального анализа (5-е издание). Испания: Мак Гроу Хилл. п. 387.

В фундаментальных исследованиях и не только

Развитие спектральной и компьютерной техники, а также появление широкого спектра доступных флуоресцирующих молекул и молекулярных комплексов, применяемых в качестве флуоресцентных меток и зондов, обусловили широчайшее использование флуоресцентных методов в фундаментальных исследованиях. В последние годы было разработано несколько новых подходов в области флуоресцентной микроскопии, которые позволили преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного разрешения ~10 нм. Эти методы стали объединять общим термином «флуоресцентная наноскопия». Можно предвидеть несколько приложений флуоресцентных наноскопических методов в биологии и медицине. Наноскопия позволяет напрямую изучать взаимодействия между белками, ДНК и РНК и, следовательно, может сыграть существенную роль в развитии геномики и протеомики, изучении физиологии клетки, понимании патофизиологических механизмов, связанных с нарушением образования сложных белковых комплексов, и т.п. .

Начиная с середины ХХ в. аналитические методы, основанные на флуоресценции, широко используются в клинической химии и молекулярной диагностике. В частности, разработаны и внедрены чувствительные методы для быстрого анализа стероидных гормонов, порфиринов, катехоламинов, метаболитов ЛП и других диагностически важных химических веществ в моче и плазме крови . С помощью иммуноферментного анализа с использованием флуорогенных субстратов проводят детекцию биомаркеров различных заболеваний.

Активно разрабатываются методы флуоресцентной диагностики in vivo . В частности, созданы флуоресцентные зонды, которые селективно окрашивают злокачественные образования и помогают выявлять их во время эндоскопического обследования или томографии . Также на основе флуоресцентной окраски тканей разработаны новейшие методики проведения хирургических операций для удаления злокачественных опухолей. Перед операцией раковую опухоль селективно окрашивают флуоресцентным красителем. Во время самой операции специальное оборудование регистрирует флуоресцентный сигнал, позволяя хирургу более точно отличать опухоль от здоровой ткани . Конечно, приведенные примеры — лишь небольшая часть подобных подходов.

Таким образом, флуоресцентные методы исследования стали весьма эффективным инструментом как в фундаментальной науке, так и в практической медицине. Тем не менее, как полагают специалисты, работающие в данной области, учитывая возрастающие темпы совершенствования спектральных приборов и компьютерной техники, все увиденное нами в свете флуоресценции до сих пор — это только начало!

Подготовил Руслан Примак, канд. хим. наук

Литература

1. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. – М.: Наука, 1989. – 277 с.
2. Peters R. From fluorescence nanoscopy to nanoscopic medicine // Nanomedicine. – 2008. – Vol. 3. – P. 1-4.
3. O’Haver T.C. Development of luminescence spectrometry as an analytical tool // Journal of Chemical Education. – 1978. – Vol. 55, No 7. – Р. 423-428.
4. Hilderbrand S.A.,Weissleder R. Near-infrared fluorescence: application to in vivo molecular imaging // Current Opinion in Chemical Biology. – 2010. – Vol. 14. – P. 71-79.
5. Kobayashi H., Ogawa M., Alford R. et al. New Strategies for Fluorescent Probe Design in Medical Diagnostic Imaging // Chemical Reviews. – 2010. – Vol. 110, No 5. – P. 2620-2640.
6. Gioux S., Choi H.S., Frangioni J.V. Image-Guided Surgery using Invisible Near-Infrared Light: Fundamentals of Clinical Translation // Molecular Imaging. – 2010. – Vol. 9, No 5. – P. 237-255.

“Фармацевт Практик” #12′ 2017

Поділіться цим з друзями!

Характеристики флуорофоров

Различные характеристики флуорофоров:

• длины волн: соответствующие пикам спектров возбуждения и излучения;
• коэффициент экстинкции (или молярное поглощение): он связывает количество поглощенного света для данной длины волны с концентрацией флуорофора в растворе (М -1 см -1 );
• квантовый выход  : относительная эффективность флуоресценции по сравнению с другими путями снятия возбуждения (равна количеству испускаемых фотонов / количеству поглощенных фотонов);
• время жизни в возбужденном состоянии  : это характерная продолжительность, в течение которой молекула остается в возбужденном состоянии, прежде чем вернуться в свое базовое состояние (пикосекунда). Эта продолжительность сопоставима с периодом полураспада возбужденного состояния;
• фотообесцвечивание ( фотообесцвечивание ): когда молекула находится в возбужденном состоянии, существует определенная вероятность того, что она участвует в химических реакциях (известных фотохимических реакциях), в частности с кислородом в виде свободных радикалов. Затем флуорохром теряет свои флуоресцентные свойства. Другими словами, когда мы возбуждаем раствор флуоресцентных молекул, определенная их часть разрушается в каждый момент, и, следовательно, интенсивность флуоресценции со временем уменьшается. Это явление может быть неприятным, особенно при флуоресцентной микроскопии , но его также можно использовать для измерения молекулярной подвижности методом перераспределения флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) или FLIP (потеря флуоресценции во время фотообесцвечивания). Локальный).

Флуориметрия и исследование воды

Какую воду можно исследовать?

Специфика метода диктует необходимость тщательной пробоподготовки для анализа. Любые твердые примеси из анализируемой воды должны быть удалены, поскольку они оказывают заметное влияние на флуоресцентные свойства вещества. Также, кислород выступает сильным гасителем флуоресценции, поэтому он должен быть максимально удалён из исследуемого раствора. Ещё один важный фактор, который необходимо учитывать до проведения флуориметрии – это то, что не все вещества способны к флуоресценции в воде. Поэтому следует знать свойства искомого вещества в пробе воды. Также, следует учитывать склонность некоторых флуоресцентных веществ к фоторазложению, то есть, следует хранить исследуемые образцы в темноте.

Что можно узнать, применяя флуориметрию?

Исследование проб воды при помощи флуориметрии позволяет с высокой точностью определять содержание и количество тех веществ, которые имеют свойство флуоресцировать в воде. Вместе с этим, высокая чувствительность метода ко внешним условиям и состоянию исследуемого вещества делает этот метод незаменимым для контроля изменений состояний веществ в биологических системах. Также, высокая чувствительность метода позволяет использовать флуориметрию в качестве дополнительного метода исследования для подтверждения или уточнения результатов спектрофотометрических исследований.

Как происходит определение показателей?

Общий принцип определения показателей пробы заключается в измерении отклика детектора при заданной длине волны и интенсивности возбуждающего излучения. В конечном результате, при исследовании методом флуориметрии измеряется величина интенсивности флуоресценции, связанная с концентрацией обнаруживаемого вещества. Эта зависимость носит экспоненциальный характер, что требует построения калибровочного графика. Этот график обычно строится с применением растворов искомого вещества с известными концентрациями и представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой описывается следующим образом:

tga = 2.3 × I0 × K × jкв. × e × l,

где I0 – интенсивность возбуждающего излучения,

K – коэффициент чувствительности прибора,

jкв. – квантовый выход люминисценции,

e – коэффициент молярной экстинкции исследуемого вещества при заданной возбуждающей длине волны.

Экономическая целесообразность метода

Флуориметры достаточно дороги в производстве и имеют высокую стоимость – порядка 35-40 тысяч долларов за базовые модели. Несмотря на определенные ограничения, накладываемые особенностями метода измерения, крайне высокая чувствительность приборов, а также и их способность измерять концентрации строго определённых веществ (т.е. высокая селективность) приводят к тому, что альтернатив им попросту нет.

Флуориметры служат важнейшими аналитическими инструментами на многих производствах – их экономическая целесообразность неоспорима. Флуориметры могут применяться для контроля сточных вод на производствах, обеспечивая высокую точность и селективность измерений при должной водоподготовке. Нет дополнительных расходов на плановые мероприятия – все действия обусловлены знанием.

Впечатляющие результаты

С помощью флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран. Согласно этой модели при всей ее структурной целости мембрана достаточно «жидкая», чтобы отдельные ее компоненты могли перемещаться в нужные стороны. Такое представление позволяет понять основные молекулярные механизмы функционирования мембран, а также свойства живых клеток в целом.

Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций, а за их координацию отвечают так называемые сигнальные системы. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только подходы, основанные на применении флуоресцентных репортеров, показали, где пролегают эти пути и как по ним проходят сигналы, благодаря чему стало возможным в реальном времени следить за взаимодействиями сигнальных белков или оценивать динамику экспрессии генов в отдельно взятой клетке. С помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить и неизвестные ранее сигнальные компоненты, например, выявить роль ионов Са+2 как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.

Схемы Яблонского

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским (Рисунок 2).

Рисунок 2. Диаграмма уровней энергии Яблонского

Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S, S1, и S2 соответственно.
Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д

Влияние растворителя во внимание не принимается

Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит примерно за 10-15 с, время, слишком короткое для заметного смещения ядер (принцип Франка-Кондона).

В возбуждённых состояниях молекулы находятся очень недолго (в синглетном состоянии обычно значительно меньше, чем в триплетном) и становятся очень реакционноспособными.

В соответствии с распределением Больцмана, при комнатной температуре большинство молекул находятся на самом нижнем колебательном уровне основного синглетного состояния S0. Именно такие молекулы преимущественно и будут поглощать излучение.

Из-за большой разности энергий между уровнями S0 и S1 по существу, ни у каких флуорофоров состояние S1 не может быть заселено термическим путем. Даже малое термически активированное заселение первого возбужденного колебательного состояния молекул можно зарегистрировать, используя различие спектров поглощения при разных температурах.

За поглощением света обычно следует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровня состояний (S1 либо S2).
3а некоторыми редкими исключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния S1. Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10-12 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10-8 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до процесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния.

Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному состоянию. Термическое равновесие достигается за время порядка 10-12 с. Интересным следствием из такого рассмотрения является то, что спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбужденных электронных состояний, а спектр испускания — колебательную структуру основного электронного состояния. В большинстве случаев электронное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в спектрах поглощения и испускания, сходны.

Молекулы в состоянии S1 могут также подвергаться конверсии в первое триплетное состояние Т1. Испускание из Т1 называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S1 в Т1 называется интеркомбинационной конверсией. Переход из Т1 в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции.

На испускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном на диаграмме Яблонского: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях. 

Применение флуориметрии в фармацевтическом анализе

Идентификация

Спектры флуоресценции специфичны для определяемых веществ. Поэтому флуоресценция может быть применена для их идентификации.

Количественный анализ

При количественных определениях интенсивность флуоресценции раствора испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции раствора стандартного образца флуоресцирующего вещества известной концентрации, измеренной в идентичных условиях на одном и том же приборе.

Методика

Растворяют испытуемый образец в растворителе или в смеси растворителей, указанных в нормативной документации. Переносят раствор в кювету или пробирку флуориметра и облучают возбуждающим светом при длине волны, указанной в нормативной документации.

Измеряют интенсивность испускаемого света под углом 90о к возбуждающему свету после прохождения через светофильтр или монохроматор, пропускающий преимущественно испускаемый диапазон длин волн.

Последовательность выполнения анализа. Вначале в прибор помещают растворитель или смесь растворителей, используемых для растворения вещества, и устанавливают регистрирующее устройство на нулевое значение. Затем вводят раствор стандартного образца и устанавливают чувствительность прибора таким образом, чтобы отклик показаний был не менее 50. Если для регулировки чувствительности требуется изменение ширины щели, должны быть повторены обнуление прибора на растворитель и измерение интенсивности флуоресценции стандартного образца. После этого вводят растворы испытуемых образцов неизвестной концентрации и регистрируют  показания прибора. В случае линейной зависимости интенсивности испускаемого света от концентрации вещества рассчитывают последнюю в  испытуемом  растворе  (C)  по формуле:

где

C    – концентрация вещества в стандартном растворе;

I  – интенсивность света, испускаемого испытуемым раствором;

I   – интенсивность света, испускаемого стандартным раствором.

Если интенсивность флуоресценции не прямо пропорциональна концентрации раствора, измерение может быть произведено с использованием калибровочной кривой.

В некоторых случаях измерение флуоресценции испытуемого образца может быть выполнено относительно независимого стандарта (например, флуоресцентного стекла или раствора другого флуоресцентного вещества). В качестве стандартов могут быть использованы: раствор известной концентрации хинина в 0,05 М растворе серной кислоты или раствор флуоресцеина в 0,1 М растворе натрия гидроксида. В таких случаях концентрацию испытуемого образца следует определять с использованием предварительно полученной в тех же условиях калибровочной кривой.

II. Методы и приборы, применяемые для изучения явлений флуоресценции.

Спектрофотометрическое определение силы флуоресценции. Если хотят усовершенствовать изучение явлений флуоресценции до источника аналитического характера, то необходимо для каждого тела определить степень интенсивности света флуоресценции и ее цвет.

Очевидно, что простое указание цвета недостаточно, даже если его выражают произвольным коэффициентом интенсивности. С другой стороны, методы, применяемые в колориметрии, определяют цвета следующим образом:

1) Можно определить окраску, тональность, т.е. длину главной волны, насыщенность, т.е. количество белого цвета, который примешан, и светосилу, оцениваемую фотометрически.

Можно оценивать цвет по действию трех основных компонентов и находить для него топографическую точку в треугольной схеме Maxwells, а затем измерять светосилу.

Эти методы, которые хорошо применимы на практике для технического определения красок и чистых цветов, очевидно, очень приблизительны. Они дают только физиологическую оценку цветового ощущения, но не определяют излучения.

Возьмем, например, белесоватую окраску, как это часто встречается. Вышеописанные методы с большой неточностью ‘передают это выражение белого. Но есть множество излучений очень различного спектрального распределения, которые могут производить одинаковый физиологический эффект.

Есть только одно правильное средство определить излучение источников, это — вычертить кривую спектрального распределения интенсивности их лучеиспускания.

Различные излучения, будучи взяты с равными интенсивностями, могут быть расположены в системе координат, по функции длины волны, с оценкой глазом светосилы; кривая эта называется кривой видимости излучений.

Если возьмем за единицу координаты излучение наиболее сильное, соответствующее максимуму ощущения глазом (λ 555), то получим цифры, приведенные на стр. 65.

Условлено, что все излучения, составляя белый свет, имеют ту же интенсивность, принимаемую за единицу. Кривая видимости передает это условие в физиологической области; можно принять, что она представляет распределение видимой силы белого света в спектре.

λ	коэфициент видим.	λ	коэфициент видим.
400	0,0004	600	0.631
420	0,004	620	0,381
440	0,023	640	0,175
460	0,060	660	0,061
480	0,139	680	0,017
500	0,323	700	0,0041
520	0,710	720	0,00105
540	0,954	740	0,00025
560	0,995	760	0,00006
580	0,870

Теперь представим, что спектрофотометром изучают, для каждого излучения, отношение интенсивности света флуоресценции к интенсивности белого света. Получают тоже кривую; достаточно помножить каждую из ординат этой кривой на соответствующую ординату кривой видимости, чтобы получить искомую кривую, т.е. кривую распределения светосилы в спектре флуоресценции. Площадь внутри этой кривой пропорциональна всей светосиле флуоресцирующего тела. Нетрудно, применяя этот метод, распределить ряд флуоресцирующих тел в порядок по интенсивности флуоресценции, каков бы ни был цвет. Для этого достаточно измерить площадь внутри соответствующей кривой.

Наставления для опытов. Спектрофотометр

Свет изученных флуоресцирующих тел очень слаб, поэтому следует обратить все свое внимание на выбор спектрофотометра, насколько возможно светосильного. Аппарат Yvоn’а, построенный Т/Д

Fobin еt Yvоn, особенно пригоден для измерений флуоресценции.

Спектрофотометрические определения производятся только тогда, когда постоянство двух источников света обеспечено.С другой стороны, частая проверка установок спектрофотометра существенна, если хотят придать получаемым результатам необходимую точность.

Приборы

Для проведения флуориметрического анализа используют приборы двух типов: фильтрационный флуориметр и спектрофлуориметр.

Фильтрационный флуориметр состоит из источника излучения, первичного фильтра длин волн, камеры для образца, вторичного фильтра длин волн и системы детектирования флуоресценции. Как правило, детектор помещен под углом 90о к возбуждающему световому потоку. Геометрия прямого угла предусматривает детектирование только произведенного флуоресцентного сигнала. Однако детектор все-таки получает часть возбуждающего излучения в результате рассеивающих свойств самого раствора, а также из-за присутствия в растворе твердых частиц. Для устранения этого остаточного рассеяния используются спектральные фильтры. Первичный фильтр отбирает коротковолновое излучение, способное к возбуждению испытуемых образцов, вторичный фильтр пропускает флуоресценцию в длинноволновой области, но блокирует рассеянное возбуждение.

Детекторы флуориметров преобразуют оптический сигнал в электрический с помощью фотоумножителей разных типов. Каждый тип детектора имеет специальные характеристики: спектральная область максимальной чувствительности, степень усиления, соотношение сигнал/шум.

Спектрофлуориметры отличаются от фильтрационных флуориметров тем, что вместо спектральных фильтров в них используются монохроматоры типа призмы или решетки. Эти приборы более предпочтительны для аналитических целей. В спектрофлуориметрах монохроматоры снабжены щелями. Чем уже щель, тем выше разрешение и спектральная чистота, но меньше чувствительность. Выбор размера щели определяется разделением между длинами волн возбуждающего и испускаемого излучения и необходимым уровнем чувствительности.

В качестве источников возбуждающего излучения в флуориметрах используют:

• ртутные лампы низкого давления, предоставляющие большое количество длин волн возбуждения, но не являющиеся источником излучения равномерного спектра;
• ксеноновые газоразрядные лампы, обеспечивающие высокоинтенсивное почти равномерное излучение в широком диапазоне спектра (300 – 800 нм) и достаточно интенсивное в коротковолновой области вплоть до 200 нм;
• лазеры, излучающие свет высокой интенсивности в очень узком интервале длин волн (не более 0,01 нм) и позволяющие благодаря этому не использовать монохроматоры или первичные светофильтры;
• светодиоды и светодиодные матрицы, излучающие свет в определённых диапазонах длин волн.

Для размещения анализируемых проб в флуориметрах используют, как правило, прямоугольные кварцевые кюветы, отполированные со всех 4 вертикальных сторон, иногда – цилиндрические кюветы или пробирки. Обычно объем испытуемых образцов составляет 2 – 3 мл, но к некоторым приборам прилагаются кюветы вместимостью от 100 до 300 мкл или капиллярные держатели для еще меньшего объема.

«Репортажи» из внутриклеточной среды

Состояние электронов, участвующих в процессах флуоресценции, зависит как от физических факторов окружающей среды, так и от общей электронной конфигурации молекулы. Именно это обстоятельство и делает флуорофор молекулярным репортером, который на языке флуоресценции сообщает о физико-химических условиях своего окружения. Заметим, что перед молекулярным репортером, так же, как и перед газетным, ставятся сходные задачи: проникнуть туда, куда поручили, и отправить репортаж с места событий. Однако если речь идет о молекулярном репортере, то слово «репортер» следует произносить с ударением на втором слоге.

В исследовательской практике ковалентно присоединенный к макромолекуле флуоресцирующий компонент принято называть флуоресцентной меткой, а свободный флуорофор — зондом

«Языком», с помощью которого флуоресцентный репортер передает информацию, являются параметры флуоресценции (интенсивность, квантовый выход, анизотропия и др.), чувствительность которых к физическим свойствам микроокружения флуорофоров позволяет характеризовать состояние внутриклеточной среды, например, вязкость цитоплазмы или гидрофобного слоя биомембран, внутреннее содержимое органелл и т.д. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на мембране: с помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала. Существуют даже репортеры для измерения внутриклеточной температуры!

Смротрите также об использовании флуоресцентной микроскопии: «Магия» в момент слияния яйцеклетки и сперматозоида